ADCs是一类在癌症治疗中具有重要应用的靶向治疗药物。它们由单克隆抗体与细胞毒性药物偶联而成，通过特异性结合癌细胞表面的抗原来释放药物，从而提高药物的靶向性并减少对正常细胞的毒副作用。由于可能的抗体-药物组合数量众多，研究者希望找到一种有效的方法，在评估动物模型的药代动力学和药效学之前，缩小具有最高和最普遍效力的ADC组成数量。使用不同的微管抑制剂药物（DM1、DM4、VcMMAE和 VcMMAF）、不同抗EGFR抗体（Cetuximab、 Panitumumab、Clone 425和Clone 528）使用光反应（oYo-Link）技术快速实现DAR值约2的ADCs，并使用三种表达EGFR的细胞系（A431、A549、MDA-MB-231）进行相关药效评估。结果显示不同载荷、抗体、细胞系的选择均可能对ADC的药效评估造成影响，论文建议在筛选ADC时，应同时考虑抗体、药物载荷和所选细胞系等多重影响，而不仅仅是抗体的亲和力。这些结论为ADC的合理设计和开发提供了科学依据，并强调了在药物开发过程中考虑多因素交互作用的重要性。
图1 ADC的药效评估需要综合考虑载荷、抗体、细胞系等不同因素影响
使用光反应（oYo-Link）技术快速实现DAR值约2的ADCs制备，大致原理如下：Protein G改造结构域（蓝色）在其C-末端包含一个可定制的毒素小分子，并且在与IgG的Fc结合的区域中含有非天然氨基酸苯乙酰苯丙氨酸（BPA），其紫外光活性的苯并噁嗪侧链以红色显示。当其与IgG的Fc区域结合并被长波长紫外光（365nm）激活时，Protein G改造结构域和IgG之间形成了一个共价键。抗体接上该基团后，重链分子量增加约8 KD，因此可以通过SDS-PAGE快速判断[2]。偶联后含毒素的Protein G改造结构域不会进入细胞，无需纯化，不会对药效评估造成影响。
图2 基于光反应（oYo-Link）技术的ADC制备原理及结果评估
为探究载荷效应对药效的影响，以Cetuximab为模型抗体，选取DM1、DM4、VcMMAE、VcMMAF为载荷，于A431细胞中进行ADC效力试验。各偶联物在41pM-30nM浓度下处理细胞，经实时活力检测，计算EC50值。结果显示，VcMMAE、VcMMAF类载荷在低至3.33nM时，48小时毒性超90%，Cetuximab-VcMMAE EC50最低(0.81nM)，VcMMAF次之(1.36nM)，而DM1、DM4 EC50显著较高(分别为8.50和8.01nM)。差异归因于载荷机制及连接子可裂解性。此外，Cetuximab、仅oYo连接药物和非靶向Rituximab-药物偶联物的三种对照均显示出最低毒性，在30nM下细胞毒性也低于20%。
图3 Cetuximab抗体偶联不同载荷后在A431细胞系中进行的剂量依赖药效评估
本研究涉及的靶向EGFR的不同抗体信息汇总如下：
Cetuximab是一种人鼠嵌合IgG1，结合EGFR的细胞外结构域III，被批准用于治疗结直肠癌和头颈癌。Panitumumab是一种全人源IgG2，与Cetuximab部分结合表位重叠，用于治疗转移性结直肠癌。抗EGFR抗体425和528是非临床用小鼠IgG2a抗人EGFR抗体。细胞结合试验测定这四种抗体与A431、A549和MDA-MB-231细胞上表达的EGFR的相对亲和力。对于A431细胞，发现Cetuximab具有最高的结合亲和力和最低的平衡解离常数(KD)，0.26 nM，而Panitumumab具有几乎相同的平衡解离常数0.28 nM。425和528抗体的亲和力降低了3~5倍，KD值分别为0.97和1.33 nM（图4）。因此，两种临床抗体对A431细胞上表达的EGFR具有比非临床抗体更大的亲和力。
尽管抗体的KD值呈下降趋势，A549和MDA-MB-231细胞的抗体结合强度的相对顺序保持不变。A549和MDA-MB-231细胞的结合亲和力增加可能是由于细胞上的靶蛋白表达较低，因为流式细胞术检测表明，A549和MDA-MB-231细胞的表面EGFR表达分别比A431细胞低约5倍和3倍。这影响结合动力学，Zhang et al[3]发现较低的EGFR密度导致较少的位阻，因此KD值较低。
图4 四种EGFR抗体在不同细胞系中的剂量依赖结合曲线和亲和力评估
选取上述四种EGFR抗体，并配备VcMMAE作为模型载荷，制备ADC后在A431细胞上进行ADC药效试验。10 nM及以上浓度下，4种ADC于48小时细胞毒性超90%。EC50值变幅达3.2倍：Cetuximab-VcMMAE最低（0.81 nM），依次为528-VcMMAE（1.29 nM）、425-VcMMAE（1.61 nM）、Panitumumab-VcMMAE（2.60 nM）。值得注意的是，此毒性排序与A431细胞上抗体结合亲和力趋势不符，Panitumumab亲和力紧随Cetuximab之后，而528亲和力最低。尽管Cetuximab和Panitumumab结合亲和力(KD值)相近，但其ADC的EC50值差异显著，提示内化率、结合位点等因素，或其组合，也是影响ADC效果的关键，而非仅限于结合亲和力。Topper等人报道[4]，Panitumumab的内化率低于Cetuximab，EGFR降解速率慢2-3倍，这可能是其偶联物毒性较低的机制。
图5 不同EGFR抗体偶联VcMMAE后在A431细胞系中进行的剂量依赖药效评估
针对以VcMMAE为载荷的ADC，分别使用表达EGFR的人表皮样癌细胞A431、人肺癌细胞系A549、人三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231这三种细胞系进行药效分析。三种细胞系的EGFR表达水平如下所示，A431的表面EGFR表达水平最高，A549和MDA-MB-231细胞的表面EGFR表达分别比A431细胞低约5倍和3倍，三个细胞系均不表达CD20。
图6 不同细胞系的EGFR表达水平对比
选择上述四种EGFR抗体，并将VcMMAE作为模型载荷，制备ADC后使用人表皮样癌细胞A431、人肺癌细胞系A549、人三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231这三种细胞系进行ADC药效试验。实验结果表明，Cetuximab-VcMMAE在A431细胞系中表现出最高的效力，但在A549和MDA-MB-231细胞系则是明显药效不佳，Clone 425-VcMMAE和Clone 528-VcMMAE在A549和MDA-MB-231细胞系表现出更高的效力。这可能是跟前面分析的A431的EGFR表达水平明显高于A549和MDA-MB-231有关。这说明在不同细胞系中，ADC的药效可能受到多种因素的综合影响，而不是单一因素决定。因此，开发ADC时需要综合考虑这些因素，以实现对特定癌症类型的最优治疗效果。
图7 不同EGFR抗体偶联VcMMAE后在不同细胞系中进行的剂量依赖药效评估
采用与A431细胞相同的方法，对四种结合VcMMAE的ADC分子对人肺癌细胞系A549的作用进行了测试。有趣的是，随着作用时间的延长，发现A549细胞对ADC表现出耐药性（如图8，以Clone 425-VcMMAE示例），细胞毒性在18~22h达到峰值，随后细胞毒性降低；而在使用相同ADC处理的A431细胞并未观察到这种趋势，这可能与基因表达的变化有关。Ikeda等[5]研究表明A549细胞中EGFR的下调和FGF2的上调与对厄洛替尼、紫杉醇、吉西他滨等化疗药物的耐药相关。因此，根据不同的细胞系选择合适的作用时间对ADC药效评估也非常重要。
图8 Clone 425抗体偶联VcMMAE后在不同细胞系中的不同时间实时杀伤药效评估
结论
载荷选择的重要性：不同的药物载荷对ADC的效力有显著影响。本研究中的VcMMAE，在与不同抗体偶联时，无论在哪种细胞系中，都显示出最高细胞毒性。
抗体选择的影响：尽管药物载荷对ADC效力有显著影响，但抗体的选择也对药效有重要影响。抗体的结合亲和力与其作为ADC的一部分时的药效并不完全相关。除了亲和力之外，抗体的其他特性（如内化率、表位等）也可能影响ADC的药效。
不同细胞系特异性：ADC的效力还受到细胞系不同抗原表达水平和不同阶段的信号通路调节的影响。针对不同的癌细胞系，可能需要选择不同的抗体或ADC组合进行综合评估。
筛选方法的建议：基于上述发现，论文建议在筛选ADC时，应同时考虑抗体和药物载荷的影响，而不仅仅是抗体的亲和力。这有助于更准确地预测ADC的药效，并为进一步的体内研究筛选出更有潜力的候选药物。
上述这些发现为ADC的合理设计和开发提供了科学依据，并进一步证实了在药物开发过程中考虑多因素交互作用的重要性。
