01、免疫相关的细胞杀伤功能分析
抗体药物参与免疫功能的调节，其中最重要的功能之一就是参与对肿瘤细胞的杀伤作用。抗体药物的作用机制是和肿瘤细胞表面抗原特异性地结合，在免疫细胞的协同作用下进行肿瘤细胞的杀伤。最常见且最重要的就是ADCC，TDCC，CDC，ADCP这四种杀伤作用。
ADCC作用
ADCC，是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity），是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞（NK细胞、巨噬细胞等）表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。
TDCC作用
TDCC，是T细胞依赖的细胞毒作用（T cell-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity），主要的参与者为CD8+T细胞，除去激活信号的正向调控以外还受到抑制信号的负向调控，最重要的信号之一就是PD-1/PD-L1，通过PD-1/PD-L1抗体对该信号通路的阻断，能够促进细胞毒性T细胞介导的细胞杀伤效应。
图2. 以hPBMC为效应细胞，BT474为靶细胞检测PD-11/PD-L1抗体介导的T细胞杀伤效应
ADCP作用
ADCP，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis），为抗体与肿瘤细胞表面的抗原特异性结合，随后抗体Fc片段与效应细胞（如巨噬细胞）表面Fcγ受体( FcγRIII (CD16A)、FcγRII (CD32A)、FcγRI (CD64) ) 结合，诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。
图3. 使用流式检测Raji与相应抗体的结合情况；使用CFSE标记Raji，使用含APC荧光素的CD14+抗体标记巨噬细胞，吞噬了Raji的巨噬细胞呈CFSE+和CD14+双阳性
CDC作用
CDC，补体依赖的细胞毒性作用（complement dependent cytotoxicity），补体通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，激活补体经典激活途径，形成的攻膜复合物裂解靶细胞的作用。当补体蛋白C1q与特异性单抗结合后，就与细胞膜表面的相应抗原结合形成复合物，起始补体系统的经典途径。接着激活补体系统经典途径，形成攻膜复合体（MAC），把肿瘤细胞裂解，最终导致肿瘤细胞凋亡。
图4. CTG检测法检测利妥昔单抗介导的人血清CDC效应
02、阻断/激活靶点生物学功能分析
Treg的免疫抑制调节试验
调节性T（Treg）细胞是一种具有免疫抑制功能的T细胞亚群，Treg细胞在对自体抗原的免疫耐受和控制对外来抗原的过度反应方面具有重要作用。目前在自身免疫病的研究方面越来越受到大家的关注。
Treg的功能检测方法分为离体和在体两种，离体实验主要通过量化Treg对效应T细胞(Tresp)增殖或混合免疫细胞群体反应(mixed lymphocyte reations)的抑制，该法被广泛采用的原因也是最大优点在于操作简便且数据可靠易重复。
最基本的离体抑制实验是通过等倍比稀释Treg的数量，研究加入CD3/CD28 通用T细胞激活物后，进行细胞计数确定Treg数量对效应T（Tresp）细胞的增殖抑制情况。
图5. 从PBMC中分离出CD4+/CD25+/Foxp3+ Treg细胞并扩增
图6. Treg和效应T细胞共培养后，对效应T细胞有抑制作用
MLR反应
混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。
图7. mDC细胞刺激同种异型PBMC后检测IL-2和IFN-γ的分泌情况，同时用PD-L1抗体处理，抗体浓度越高，IL-2和IFN-γ分泌越多，表明PBMC中T细胞被激活程度越高
03、其他体外药效学分析
流式多因子定量检测分析
传统的ELISA检测细胞因子，一块板只能做一种因子，且样品用量较多，实验时间较长，遇到少量珍贵样品就没办法用ELISA进行多个细胞因子的检测。目前针对多因子定量检测方法常用的有CBA和Luminex。
CBA
CBA (cytometric bead array system)其原理跟ELISA相似，也是双抗夹心，不过把包被好捕获抗体的96孔板替换为了包被了荧光素和抗体的聚苯乙烯微球，通过流式检测微球上包被的荧光素强度不同来实现多个因子同时检测。
Luminex
Luminex平台是将传统的ELISA和流式细胞术相结合，定量检测多种细胞分泌性因子的含量。该平台是基于XMAP微球检测技术，该方法可以实现同时对细胞因子、趋化因子和生长因子等进行快速检测和定量分析。检测系统结合流式、荧光标记的微球和独特的数字信号处理系统能够一次从单个样品中获得100多个指标数据信息，具有较高的通量。
流式细胞仪细胞磷酸化分析
蛋白激酶将磷酸基团从ATP转移到蛋白多肽底物上的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，直接影响目标的活性和功能。真核细胞中大约30%的蛋白经过磷酸化修饰。这一关键的翻译后修饰调控了广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯。此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。
流式细胞术相比于Western Blot、ELISA、IHC等方法，有自己的方法优势，可实现快速、定量的单细胞分析。通过细胞表面标志的分型可检测异质群体中特定细胞类型的蛋白，而无需在物理上分离细胞。通过这种方法可分析稀有的细胞群体，而不用担心细胞损失或细胞分选过程中可能发生的蛋白表达变化。
图8. 以IL-2刺激PBMC，检测CD4+T细胞、NK细胞、CD8+T细胞中的STAT5磷酸化，确定PBMC中淋巴细胞的激活情况
用于TIL分析的标准小鼠FACS平台
在研究肿瘤免疫过程中需要对肿瘤组织中免疫细胞浸润的情况进行分析，通过流式细胞术能够对人源、鼠源、肿瘤细胞、免疫细胞等不同细胞进行标记和分析，确定肿瘤组织中免疫细胞浸润的情况和免疫细胞激活的情况，从而评价抗体药物的有效性。
图9. 人源化小鼠的肿瘤组织分离出单个细胞，检测人源细胞CD45、CD206亚群比例
抗体药物红细胞凝集效应
CD47，也被称作整合素相关蛋白（Integrin-associated protein, IAP），是一种在正常细胞表面广泛存在的跨膜蛋白。CD47在多种实体瘤细胞及恶性血液瘤细胞上呈现高表达，而且其表达水平与疾病进展呈正相关。由于CD47和SIRPα结合后可以抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，因此通常在肿瘤细胞表面过表达，导致了肿瘤细胞的免疫逃逸。这意味着CD47或将是继PD-1之后肿瘤治疗领域的下一个重要靶点。
人成熟红细胞表面同样表达CD47分子，因此在CD47抗体药的研发过程中需要注意，研发的药物是否具和红细胞表面CD47结合而导致的溶血反应。因此，通过抗体药物的红细胞凝集效应分析可判断该抗体药对肿瘤表面CD47特异性的强弱，也对药物的安全性做出了评价。
图10. CD20和CD47抗体的红细胞结合凝集实验
