小白学药 | 新药药效学研究的思路和方法

① 随机（randomization）

◆ 完全随机化法

◆ 配对随机法：先将动物按性别、体重、窝别或其他因素加以配对。

◆ 区组随机法：将全部动物按性别、体重、及其他条件分成若干组。如实验需要分两个组

② 对照 （control）

◆ 没有比较就没有区别。

◆ 所谓“对照”，即设立非处理因素相同、而处理因素与试验组不一样的一组对象。

◆ 实验组与对照组的实验动物在种属、性别、窝别、体重、健康状况等方面要尽可能相同。

对照有多种形式。

③ 重复（replication）

◆ 一是在同样条件能将实验结果重复出来，即具有重现性；（抗肿瘤实验要重复三批动物试验）

◆ 另一意思是在实验中应有足够的动物数或实验次数，即应具有一定的样本数。 

④ 药效学研究的常用方法

◆ 体内试验法（重现性较体外实验差，但接近人体情况，是药物有效性必须评价的内容。）

◆ 体外试验法

血清药理学：将受试药物经口给与动物后，取其血清作为药源加入体外反应系统中研究其药理作用。该方法的干扰因素太多，其应用的可靠性存在争议。

新药药效学试验以体内实验为主，体外实验为辅。 

⑤ 药效学研究的常用给药方法

◆ 预防性给药

◆ 治疗性给药（常用）

◆ 防治结合的给药方式

① 内容

  ◆ 体外药效学试验

  ◆体内药效学试验

  ◆ 作用机制研究

② 原则

  ◆ 先体外，后体内；先重要，后次要

  ◆试验方案依据、条件简介

  ◆ 试验结果、分析、评价

① 评述体外/内试验主要结果

② 预测可能提示的临床意义   

③ 药物作用的起效和持续时间

④ 活性强度，量效关系

⑤ 有效剂量（IC50或ED50）等

⑥ 结果是否支持拟定的适应证/功能主治？

⑦ 作用机理研究能否确认？

⑧ 不能确认或有矛盾的试验结果如何处理？

① 对使用特殊溶媒未设对照不进行解释

② 药效未反映量效关系或时效关系的原因不分析

③ 阳性药未显示应有的疗效的原因不清

④ 数据未进行统计学处理或选择方法不妥

⑤药物的特点未分析、总结

⑥结果缺乏专业分析、讨论、评价

问题1  对受试药物的要求

◆ 如果用原料或中药提取物做试验，要求符合暂定的质量标准。

◆ 如果用制剂做试验，要求处方固定，制备工艺、药品质量标准应基本稳定。

◆ 要向药理毒理研究者提供书面的受试药物的质检报告。

◆ 药效、毒理应采用同一批号的受试药物。原则上要求中试样品。

◆ 不同给药途径对受试物的要求不一样。

问题2   如何选取动物模型？

◆ 要求：公认性；与临床疾病的相似性。

◆ 类型：自发性动物模型（难得）及诱发性或实验性动物模型（常见）两大类。

◆ 很多动物模型有待改进、完善，更多的有待于创新建立。

动物模型

自发性动物模型：突变系的遗传疾病和近交系的肿瘤模型，如高血糖小鼠、肥胖症小鼠、高血压大鼠等。

实验性动物模型：通过化学、物理、生物等因素，人工诱发器官、组织或全身性损害，如动物发热模型、动物佐剂性关节炎模型、四氧嘧啶所致糖尿病大鼠等。

实验动物

实验动物的三个特殊要求

● 人工培育，遗传背景清楚

● 生活环境设施应达国标中的等级标准

● 专门用于科研、教学、生产、检定、实验等。

常用实验动物

小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠（仓鼠）、

兔、犬、猴、猫、小型猪、鸡等。

问题3   如何选择实验动物？

１、选用与实验动物模型要求相适应的实验动物规格（年龄、体重、性别等）

如二甲苯致耳廓肿试验，雄性，25~30g；抗炎试验多选用雄性动物。

２、无特殊要求的，选成年健康动物，各种动物体重为：小鼠，18~22g；大鼠，150g~250g；家兔，1.5~2.5kg；比格犬，8~10kg；每一批动物体重相差不超过±20%。

３、选用解剖、生理特点符合实验目的要求的实验动物。同品种不同品系的动物存在特殊的反应，应注意选择应用。如Wistar大鼠、SD大鼠等。

４、选用与人的机能、代谢、机构和疾病特点相似的动物。（猕猴、犬、猫、猪等）

５、选用人兽共患疾病的实验动物和传统应用的实验动物（SARS:果子狸,禽流感：鸡）

６、实验动物的选择和应用需注意符合相应的国际规范（GLP、3R原则）

动物实验应注意的问题

问题4   观察指标如何选择？ 

① 特异性 ：如治疗类风湿关节炎药，抗炎、镇痛、免疫调节等。

② 客观性：尽量使用仪器。

③ 量化性：对质反应指标采用计分法，定量组织学方法，人为地进行定量或半定量。 

④ 重现性 ：指标稳定，重现性好。

问题5  如何确定药效学试验的剂量？  

临床等效剂量：根据体表面积折算法在同等体表面积单位时的剂量。（适用于安全系数小的药物如抗癌药等）

根据临床用量的体重计算（常用）：根据人用剂量按体重计算。

根据半数致死量（LD50）计算：可用其1/20～1/10做为有效剂量的预摸。

根据文献估计剂量

考虑长毒剂量设计：药效试验高剂量组应低于长毒试验的中剂量组或低剂量组，为此药效试验的高剂量组，不宜超过人用量的20倍(指大鼠试验)。

根据预试验测定剂量：通过预试验找出最小有效量，再做正式试验。预试验应以等效剂量为标准进行预摸。正式实验时常常以等效剂量作为中剂量，大、中、小剂量差为2～3的等比级数为宜。

问题6  如何设置剂量组？           

① 主要药效学试验应设三个剂量组，犬与猴等大动物可设2个剂量组；

② 通常按等比数原则，整体动物剂量按2倍或3.16倍递增，离体器官剂量按3倍或10倍递增；

③ 安全范围较小的药物（如抗肿瘤药物）可采用等差级数分组；

④化药和纯度比较高的1、5、7类中药新药应尽量作出量-效和时-效关系。

⑤ 进行药效对比时，一般选用中效剂量。

问题7  怎样给动物麻醉？ 

1、不同的麻醉剂有不同的药理作用和副作用，应根据实验要求与动物种类而加以选择。

2、麻醉深度的控制是顺利完成实验获得正确实验结果的保证。

麻醉期间要采取保温措施。

3、静脉注射必须缓慢，肌紧张和痛觉消失应停止注射。多用腹腔注射。

4、麻醉深度不够，要经过一段时间才能补充麻醉剂。补加剂量不超过原注射量的1/4~1/5。

◆ 常用局部麻醉剂

普鲁卡因：毒性小，见效快， 0.5%～1%用于局部浸润麻醉；

利多卡因：见效快，组织穿透性好， 1%～2%用于大动物神经干阻滞麻醉， 0.25%～0.5%用于局部浸润麻醉。

◆ 常用全身麻醉剂

乙醚：安全度大，麻醉深度易于掌握，麻醉后恢复快。适用于各种动物，尤其是做慢性实验的动物。

戊巴比妥钠：一次给药的有效时间可延续3h ~ 5h，毒性小，便宜。常配成3%生理盐水溶液，可加温溶解，在常温下放置1～2月不失药效。适用于急性动物实验。狗，iv 或ip 30 ~35mg/kg，猫、兔、鼠 ip 40～45mg/kg。 

问题8  如何设立对照组？

● 正常对照组

● 模型对照组  

● 阳性

模型阳性药

上市销售的已知有效的同类药物

● 原剂型对照 

问题9  阳性对照药的选择要求

可比性：药效肯定的同类中药或化学药，要求作用（或主治）相同，给药途径尽量一致。

合法性：应用《药典》或部颁标准收载，或近来批准生产的合法药物。

择优性：选用目前医学界公认有效的代表药。

● 一个受试药可能有几个阳性对照药；

● 阳性药可设一个或多个剂量组；

● 给药时间和给药途径既要考虑受试药物能完全发挥作用，也要兼顾阳性对照药的作用特点，不强求同步一致；

● 模型阳性药必须作出阳性结果，否则有理由怀疑所选方法和指标的可信度。

问题10  每组样本量如何确定？

小动物（大鼠、小鼠、蛙）：10～30例，计量资料≥10例,计数资料≥30例；

中等动物（兔、豚鼠）：8～12例。计量资料≥6例,计数资料≥20例；

大动物（犬、猫、猴）：5～15例。

避免干扰因素：动物、仪器、药物。

问题11  如何进行数据统计？

定量资料：又称量反应资料（如血压、尿量、体温、血液生化测定值等）。多采用t检验和方差检验。

定性资料：又称质反应资料，（如死或不死,惊厥出现或不出现等），试验结果常用百分率表示。采用“卡方”检验。

分级资料：也称为有序的计量资料，（如药效的持续时间、病理程度按等级划分的资料等）。常采用秩和法及Ridit法等非参数统计分析方法。

● 数据在Χ±3s之外的属异常数据，要分析原因。

● 使用方差分析，要进行方差齐性检验。如两组的S相差一倍以上即为方差不齐。

● 使用t检验，要进行正态性检验。如均数两侧之差大于2×√n，即为明显偏态。

● 有无不定值。有＜10，＞30等不定值的资料时，不宜用均数作t检验．可改用中位数表达。作Mann—whitney秩和检验，等级和检验，或序值法检验。

● 有无时序关系。有用药前及用药后(包括各时间)的资料，应以各组用药前数据及用药后变化率或变化值进行两组t检验，不宜以用药后实测值进行检验。（如体温、血压变化等）

问题12   如何撰写主要药效学申报资料？

摘要

试验目的

试验设计背景和思路

材料

受试药物的来源、批号、所含有效成分的量等；

阳性对照药应注名明生产单位、批号、规格等；

试剂等应注名明生产厂家、批号、级别等；

动物的种属、性别、年龄、体重、饲养条件、提供单位和合格证等；

主要仪器的型号、规格、生产厂家及主要性能参数；

实验环境。

方法　

剂量、给药周期设置依据。　

讨论　

受试药的疗效，作用范围和强度，起效快慢和持续时间，与同类药（或原剂型）的比较，对试验有关问题的解释和分析。

结论　

对受试药做出客观评价。

参考文献

实验日期、单位地址、试验者（职称）、联系人、电话等

实验结果的表达

● 无论定量或定性实验结果，均要求列表表达。

● 数据表内容通常包含实验分组、给药剂量、每组动物数、指标数据和统计结果显著性标示。

数据表达：详细，并有原始资料。均数至少有3位有效数字，标准差有2位有效数字，均数的小数位数应与标准差相同。应写均数、标准差、例数、p值情况。

图标表达：** p　<0.05

统计表达：无显著意义，有显著意义，有非常显著意义。应写明统计方法。