ADC药物的临床前药效评价

ADC（Antibody-drug conjugate，ADC）药物全称为抗体偶联药物，是将抗体通过偶联臂（Linker）与小分子药物（Payload）共价连接的复合物。抗体负责靶向病灶，毒素通过自身特性杀伤目标细胞，连接子则是承担桥接毒素和抗体直至ADC到达肿瘤细胞内再进行释放的功能。一个理想的ADC分子应该具备高靶点特异性、高肿瘤杀伤能力、长药代特性、低免疫原性、低脱靶毒性。

图1. ADC药物的组成、特点[1]

02、ADC药物主要的作用机制

目前，FDA共批准了13种ADC。下表总结了这些药物的设计、批准的适应症、剂量和不良事件。

数据来源：

https://www.biochempeg.com/article/74.html

在ADC药物的药效评价方面，吉凯基因提供一站式的体内外药理药效研究。已经服务过数十个ADC药效评价的项目，具备IND项目服务的经验。针对临床前的药效研究，我们将从ADC药效研究最关注的5个阶段（抗原结合、内吞作用、载荷释放、细胞杀伤、肿瘤抑制）给大家做介绍。

针对ADC与抗原结合能力的检测，有分子水平和蛋白水平检测两种方式。分子水平上，ELISA可以作为一个好的初步研究起点。Biacore 是一个强大的工具，可以判定ADC与抗原结合的Ka、Kd等动力学参数。

在分子水平确认了结合能力之后，需要寻找靶点阳性的细胞来进行细胞水平的结合能力确认，一般采用流式细胞术进行检测。以下为细胞水平ADC与抗原结合能力检测结果示意图。

图3. FACS检测Enhertu、裸抗与SK-BR-3细胞的结合能力

ADC药物与肿瘤细胞表面抗原结合后，其主要的抗肿瘤机制是通过受体介导的内吞作用进入到溶酶体中，释放毒性小分子产生的，所以ADC的药效学研究很重要的一步是研究ADC的内吞动力学。

经典的内吞能力研究，多用酸性pH敏感的荧光染料来标记ADC抗体。当ADC分子被细胞内吞后，因环境的pH值较低，标记的ADC会释放荧光信号。我们可以通过流式细胞仪、高内涵和活细胞成像等方法来确定ADC在不同内吞时间中的内吞作用。

图4. Enhertu、裸抗的体外内吞能力检测

针对ADC结合抗原后抗体Fc端介导的杀伤作用，检测方法有很多种。无论是ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)，还是ADCP(Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，抗体依赖的细胞介导的吞噬作用)，都涉及到肿瘤细胞和免疫细胞的共培养体系。ADCC一般检测靶细胞LDH的释放。ADCP则采用对肿瘤细胞进行标记后，通过FACS检测肿瘤细胞和巨噬细胞双阳的比例来反应ADCP的效应强弱。

图5. ADC Fc端介导的抗肿瘤效应检测

ADC药物在溶酶体内被降解释放出游离毒素，这些毒素能否按照预期产生杀伤肿瘤作用，是药物效果的关键影响因素之一。不同的载荷药物，其具体作用机制的研究都有一定的针对性。目前已上市的ADC常见有DNA损伤类和微管蛋白阻滞类两大类毒素，而细胞凋亡则是这两种毒素能造成的结果，也是抑制肿瘤的直接原因。

图6.小分子载荷药物的作用机制研究

（上：DNA损伤；中：细胞凋亡；下：细胞周期）

旁观者效应（Bystander efficacy）是指部分ADC药物的载荷在释放后可以渗透穿过细胞膜，进入到肿瘤微环境中，渗透进入靶点阴性的肿瘤细胞并进行杀伤。由于肿瘤的异质性，不是所有肿瘤细胞都有ADC药物靶点的表达，旁观者效应在肿瘤治疗研究中有非常重要的价值。

旁观者效应体外评价实验，将ADC靶点抗原高表达和阴性表达的细胞进行混合培养，加入ADC孵育，检测两种细胞的生长抑制状态。一般采用流式细胞术的方法检测ADC药物阴性表达细胞系的杀伤情况，可以评价旁观者效应。如图7，将MDA-MB-468细胞（Her2阴性）和SK-BR-3细胞（Her2阳性）共培养过夜。用10nM Enhertu和溶剂处理5天后，通过细胞计数仪和流式细胞仪分别测定HER2阳性和HER2阴性细胞的数量和比例。流式结果分析表明， Enhertu对Her2阳性细胞和阴性细胞都有很强的杀伤作用，则认为存在旁观者效应。

图7. 体外旁观者杀伤效应

基于免疫缺陷动物的肿瘤模型是应用最广的一类，包括近200个CDX和300个PDX，这类模型适合评价ADC对肿瘤细胞本身的抗肿瘤作用。在下图的CDX和PDX模型中，给药组的肿瘤生长都受到一定程度的抑制。

图8. ADC药物在CDX/PDX模型中的体内抗肿瘤疗效研究