中药药效物质基础发现的策略及其迭代发展历史（英文翻译）

几千年来，中医药在中国的医疗卫生体系中发挥着重要作用，发现有效的中药成分是药物创新的关键一步[1]。例如，青蒿素是一种源自青蒿的抗疟中药，近年来已挽救了全球2亿人的生命[2]；小檗碱是一种从中草药黄连和其他小檗属植物中分离出来的异喹啉生物碱，已被证明是一种很有前途的多功能药物，可用于治疗消化、代谢、心血管和神经系统疾病[3–4]；紫杉醇是一种天然抗肿瘤药物，广泛用于治疗乳腺癌、卵巢癌和肺癌[5]。此外，在预防和控制COVID-19等严重传染病方面，中医药表现出广泛的优势[6]。清肺排毒颗粒、化湿败毒颗粒、宣肺败毒颗粒等新配方涌现[7]，一种新型有效的化合物香芋苷在清肺排毒颗粒中被证明通过下调USP14来促进活化转录因子2的降解，从而发挥抗炎作用[8]。此外，中医在治疗心血管、脑血管方面具有独特的优势[9]和复杂的代谢性疾病[10]。丹参酮IIA是丹参的主要脂溶性成分，通过增强血管生成显示出显著的心脏保护作用，可作为治疗心血管疾病的有效方法；它影响多种信号通路，包括抗增殖、抗凋亡、抗炎和抗氧化应激通路[11]。中医药的疗效和治疗理念在世界范围内越来越受到关注。国际上对中药的需求不断增长，也为中药和药物研发的发展提供了广阔的空间。

然而，中医的理论体系、诊断和治疗方法与西医明显不同。从中医的角度来看，这种疾病大多被描述为一种综合征（证），治疗是基于称为配方的草药组合；证与配方的对应是功效的前提[12]。不同的综合征需要不同的配方来逆转失衡和恢复体内平衡[13]。此外，复方的复杂性和综合征的模糊性使得识别与临床疗效相关的有效成分和机制具有挑战性。发现中药的活性成分，评估其疗效，阐明其靶点和途径，是解释中药原理、揭示配方相容性内在规律、设计治疗当前慢性病新方的关键步骤。

几十年来，研究人员已经制定了识别有效成分的策略。随着现代分析技术和系统生物学的进步，中药有效成分的鉴定方法建立在系统性和完整性的基础上。来自麻黄碱，一种用于放松气管平滑肌的活性药物[14]，青蒿素，一种安全有效且可解决耐药性的新型抗疟药[15]，该方法已从植物化学方法发展到生物活性引导分离。最近，中药血清药物化学的出现为快速筛选中药体内有效成分奠定了基础[16]。代谢组学是最具表型的组学研究，它的发展使中医证候的代谢谱和生物标志物得以表征，并创建了体内活性制剂成分与中医证候内源性生物标志物之间相关性分析的研究模型。因此，Chinmeomics（中医方证代谢组学）的研究策略诞生了[17]。本文基于CNKI和PubMed，总结了不同版本的中药有效成分发现方法，有助于阐明中药有效成分，促进先导化合物和创新药物的发现，助力中药现代化。

有效发现中药成分的策略版本更新：

基于提取、分离、纯化、结构鉴定和活性测试的植物化学方法：1.0版

最初，有效成分的发现主要基于植物化学方法。提取是通过煎煮、回流和有机溶剂超声识别草药有效成分的第一步。提取物必须根据性质（溶解度、pH值、吸附、分子量）使用色谱柱进行分离和纯化，以获得纯化合物，然后使用红外光谱、紫外-可见吸收光谱、核磁共振和质谱法鉴定化学结构。随后，使用生物学方法测试单一化合物的活性，以最终确定活性成分[18]。纯化化合物的常用分离技术包括低中压色谱柱[19]、薄层[20]和制备色谱法[21]。具体工作流程如图1所示。该方法具有可操作性强等特点，可分离制备大量化合物，是中药有效成分早期常用的广泛应用方法，取得了显著效果。

图 1：经典植物化学方法筛选中药有效成分的工作流程

这种策略应用最具代表性和最早的例子是在中药麻黄中的麻黄碱的发现。永井于1887年从这种麻黄中分离出一种生物碱，将其命名为麻黄碱，并发现它具有散瞳作用；Amatsu 和 Kubota 描述了1918年麻黄碱后血压升高和肠道松弛[22]。中国药理学家陈国强于1927年对麻黄碱的药理作用进行了系统研究，发现麻黄碱在临床上是稳定的，因此年龄、暴露于光或沸腾不会改变其作用；麻黄碱具有持久而均匀的作用，与肾上腺素相反；麻黄碱毒性低，安全边际极宽，可以方便地口服或肌肉注射给药，而不会产生局部刺激[23]。

喜树碱是一种生物碱，于1966年从喜树中分离出来。使用标准方法从干燥的植物材料中连续提取热己烷-庚烷，然后用95%乙醇进行类似的提取。乙醇提取物浓缩物在水和氯仿之间分配。对氯仿提取物中的甲醇不溶性物质进行硅胶色谱分析，然后用甲醇-乙腈结晶，结果显示喜树碱呈淡黄色针状。喜树碱在L1210白血病小鼠中测试，可延长存活率高达100%；在Walker 256（肌肉注射）大鼠肿瘤中，浓度低至1.25mg / kg显着抑制生长；此外，它对KB细胞培养物（ED50= 0.07 μg/mL）[24]。

五味子蛋白提供了另一个例子；1961年，Kochetkov等人阐明了其平面结构；随后，五味子中的五味子脂素A、B、C、F和G逐渐被分离[25]。对小鼠睡眠时间、活动和肌肉状态的评估表明，五味子脂素具有镇静或镇静作用，它的功效是持久和强烈的，而五味子醇甲的功效是短暂的。然而，五味子脂素的镇痛作用不如五味子醇甲[26]，其他代表性研究见表1[27-46]。

表1：采用经典系统分离筛选方法对中药有效成分的代表性研究（部分）

除上述成果外，该方法还存在一些缺点：操作繁琐、实验周期长、透明度较低、消耗量较大。此外，分离出的化合物通常没有活性或活性较弱。此外，一些含量低的活性成分在分离纯化过程中可能会丢失。由于分离化合物的产量限制和活性测试方法，一些成分几乎无法停留在结构鉴定的水平。相比之下，大多数使用系统分离的筛选方法都集中在新的化学结构和新化合物的发现上。此外，活性评价模型与传统功效的相关性较低；因此，研究结果对阐明中药有效成分的帮助有限。

生物活性引导分离：2.0 版

生物活性引导分离是一种以药理活性为导向的中药有效成分筛选方法。主要方法在灵敏可靠的活性评价指导下，从全提取开始，测试每一步分离的馏分/成分的活性，跟踪和分离活性成分，最终得到有效成分[47]。该过程可以简单地概括为两个步骤。第一步涉及粗略分离；中药材依次使用不同极性溶剂进一步提取，得到相应的提取位点或大孔吸附树脂、离子交换树脂、葡聚糖凝胶等成分分离。所有获得的成分都使用活性测试进行检测，粗略分离的成分显示生物活性，称为有效成分。第二步涉及精细分离；将有效组分装入分离柱中，用洗脱液萃取，最后通过重复柱层析分离得到单体化合物。随后，对从每次分离中获得的成分进行活性测试。通过跟踪和分离得到的单一化合物的结构是根据其物理和化学性质以及光谱数据确定的。工作流程总结如图2所示。生物活性引导的分离与同时的化学分离和活性评估大大减少了分析的盲目性，并节省了不必要的分离和非活性组分的制备。基于该方法，已发现活性成分众多，结构清晰，药理作用显著，机理相对明确。其中一些已经发展成为临床医学，并逐渐创造了一种利用天然产物的新药开发模式。

图 2：生物活性引导分离法筛选中药有效成分的工作流程。

青蒿在公元 340 年葛洪撰写的《急诊治疗处方手册》（肘后备急方）中首次指出可以减轻与疟疾症状相关的发烧。通过常规加热提取方法获得的提取物的抗疟活性不是最佳的。研究人员提出，青蒿的活性成分可能会在加热下的提取过程中被破坏。随后，受葛洪手册的启发，提出了一种植物的低温提取方法，指示“将一把青蒿浸入2升水中，挤出汁液，然后全部饮用”。乙醚提取物在感染伯氏疟原虫的小鼠中产生了令人鼓舞的结果，最终，1971年10月4日，通过使用乙醚浸泡或蒸馏青皿，获得了无毒的中性提取物[2]，对感染伯氏疟原虫的小鼠和感染食蟹猴疟原虫的猴子具有100%的疗效。通过抗疟活性进一步分离提取；倍半萜烯活性成分被鉴定为青蒿素，并于1979年报道[48]。

紫杉醇是从红豆杉的茎皮中分离出来的，具有强大的抗白血病和抗肿瘤特性；它是第一个具有紫杉烷环的化合物，已被证明具有这种活性。将茎皮的醇提取物浓缩并分配在水和氯仿之间。在各种白血病系统中的测定指导下，在Sephadex LH-20和硅胶上对氯仿提取物的残留物进行三次连续色谱，然后从甲醇水溶液中结晶，显示紫杉醇为针[15]。表2总结了其他代表性研究[49–84]。

表 2：生物活性引导分离中药有效成分的代表性研究

一般来说，使用生物活性引导分离分离的大多数单一化合物都具有足够的活性，并且发现的有效成分的命中率远高于1.0（植物化学方法）。但是，这种方法有一定的局限性；仍然需要大量的分离和准备，这既费时又费力。此外，中药具有多成分、多靶点的特点；因此，使用单一或几个指标筛选的有效成分不能完全反映中药的所有有效成分。重要的是，这种方法仍处于体外阶段，无法反映体内各种成分的生物转化，也无法证明药物在体内吸收、分布、代谢和消除过程中的相互作用。因此，生物活性引导的分离是初步筛选活性中药成分的基本方法。

中药血清药理化学：3.0版

1980年代，日本学者田代正和首次提出了“血清药物化学”和“血清药理学”的概念。一些成分在口服生药后被选择性吸收，这些化合物通过循环到达其靶点并发挥有效作用[85]。基于血清药物化学，王喜军对中药方剂进行了大量研究，如茵陈蒿汤（YCHD）[86]、茵陈五苓散87]、六味地黄丸[88–89]等。通过将血清药理学与中医药理论和临床实践相结合，提出并确立了中药理学的理论和方法[16]。该方法涉及中药样品制备和质量控制、样品给药、采血和血清制备、分析和检测。一般而言，该方法采用现代分离技术，对口服中药配方后人/动物血液中的成分进行分析鉴定，以鉴定血液中源自复方的化合物。这种方法反映了复方药物及其成分组合的协同作用以及草药、肠道菌群和人体之间的相互作用，最终在体内识别出直接有效的成分[90]。具体步骤如图3所示。中药血清药理化学可以有效避免体外化学成分盲目分离造成的假阳性或假阴性。基于这种方法，已经分析了许多草药和中药配方。以YCHD和刺五加（AS）为典型案例，详细介绍了该方法。

图 3：中药血清药理学筛选中药有效成分的方法工作流程。

YCHD记载在东汉（公元25-220年）张仲景撰写的《伤寒论》中，是治疗黄疸综合征（Yang Huang syndrome，YHS）的代表性经典方剂。该配方包括三种中草药：茵陈、栀子、大黄。在严格的质量控制下，共检出45种化合物，血液中鉴定出21种化合物，包括苦普罗辛酸、绿原酸、6-甲醇香豆素-7-羟基硫酸盐、7-甲氧基香豆素-6-羟基硫酸盐、金尼根二苷、金尼泊苷、藏红花黄A、毛细血管素A、异弗拉西丁、槲皮素-3-O-糖苷、6,7-二甲氧基香豆素、2,5-二甲基-7-羟基色酮、嵌合素、6-脱薄荷氧基毛细血管素、毛细血管素、莱茵和大黄素[91]。给予不同成分（完整配方，去除一种组合草药或单一草药）的YCHD后的血清样品分析显示，21种化合物中有8种仅从完整配方中吸收；有趣的是，这八种化合物比其他化合物具有更强的保肝和利胆活性。这些发现说明了中药配方相容性的科学意义[92]。对血液中主要化合物（即 6,7-二甲氧基七叶素、栀子苷和大黄素）的药代动力学分析表明，与完整配方相比，这些化合物的药代动力学特性要好得多；这三种草药在体内协同作用[93]。生物分析区将这种现象描述为“三个人是一群人：但三个人可能比一个人更好”[94]。

AS具有抗应激、抗溃疡、抗辐射、抗癌、抗炎、保肝等作用[95]。口服AS提取物后，在血液中检测并鉴定出19种化合物；其中，11种为原型成分，如原儿茶酸、刺五加苷B、绿原酸、咖啡酸、刺五加苷E、异芙萘素；8种为代谢产物，多为刺五加苷B的代谢产物。此外，结果表明，异呋喃苷素在体外含量较小，但在体内含量较高。口服AS提取物后血清中异呋喃西丁的时程表现出双峰吸收，这与单药给药异弗拉西丁完全不同；这一发现可能是游离型异呋喃西丁与相关前体化合物（刺五加苷B1）的生物转化的结合行为。结果表明，AS提取物是异芙萘素的天然缓释体系，与单一化合物相比，具有更高的生物利用度和更持久的效果。这些结果解释了AS提取物和单一异芙拉苜丁给药之间的差异，并揭示了中医固有的持久作用[96]并显示了中药血清药理学的优势。此外，随着检测技术的不断进步，中药血清药理化学得到了广泛的应用；相关研究见表3[97–120]。

表 3 血清药物化学对中药有效成分的代表性研究

中药血清药理学的出现，是中药活性成分研究的革命性突破，也是从体外分离到体内分析的飞跃。结果不仅反映了配方药和草药之间的相互作用，还反映了人体对药物的影响。该方法已广泛应用于中药药效学和药代动力学领域。然而，仍然存在一些局限性。最关键的弱点是，在血液中发现的已鉴定成分仍然与疾病靶点和通路无关；特别是，这些成分与中医证候的生物标志物无关，也不反映中医配方的临床疗效。通过将中药的血清药理化学与综合征代谢组学相结合，建立体内（不仅限于血液）中草药化学成分与综合征标志物之间的关联，以找到与临床疗效高度相关的成分，将克服这一弱点。此外，还有其他问题有待解决。例如，一些具有强活性的草药成分可能无法被吸收；相反，它们会影响肠道菌群，并且使用这种方法可以忽略这些成分。血清中低含量成分的富集和检测也是主动成分筛选的挑战，每种中药成分在血清中达到峰值浓度的时间并不均匀；因此，需要建立更全面、更准确的血液成分检测方法，以完善中药血清药理化学的理论和方法。

Chinmemomics方法：3.0 plus版

中医方证代谢组学

中药的有效成分是在体内显示出临床疗效并与疾病靶点相关的化合物。根据中医理论和临床实践，该病被描述为一种综合征（证），称为配方的草药组合用作临床药物必须与该综合征相对应[121]。一种草药可能含有数千种具有单独生物活性的化学成分；然而，由于不同综合征的配方组合不同，同一草药的吸收成分是不同的，这是由于配方相容性和相应的综合征造成的[122–123]。因此，当配方显示对综合征有效时，分析体内成分是识别与疾病治疗相关的化合物的更好选择。然而，长期以来，中医证候没有客观的诊断标准，诊断依赖于从业者的主观认知分析和判断[124]。由于缺乏中医证候的诊断参数，无法准确评估配方的有效性；因此，无法在体内鉴定与临床疗效相关的配方有效成分。因此，解释一种综合征的生物学特征和综合征生物标志物是评估疗效和发现中药有效成分的前提[125]。

中医证候是功能障碍状态，是机体对各种环境变化和内外致病因素的反应。该综合征的本质是基于身体失衡引起的代谢网络变化[121]。代谢物既代表了基因组的下游输出，也代表了环境的上游输入，它们可以为疾病的根本原因提供独特的见解[126]。因此，代谢组学技术可以通过对内源性小分子代谢产物的非歧视性分析，促进综合征/疾病生物标志物的发现以及综合征靶点和代谢途径的探索。王喜军教授将中药血清药理化学与代谢组学相结合，提出并确立了“中药组学”的研究策略[127]。一方面，利用代谢组学技术阐明中医证候的生物标志物，并根据中医证候的代谢组学特征和生物标志物评估复方的疗效。另一方面，利用中药血清药理化学在复方显示疗效时在体内鉴定活性成分，利用大数据分析和生物信息学进一步挖掘复方成分与综合征内源性生物标志物之间的相关性，将与复方疗效高度相关的成分识别为中药有效成分[128]。该策略的流程图如图 4所示。该方法由四项关键技术组成：识别综合征生物标志物、复方精确疗效评估、体内复方成分表征以及挖掘成分与综合征生物标志物之间的相关性[17]。这种方法已被广泛接受和引用；《自然》杂志推荐它作为中医疗效评估的有力方法，中医是中医和西医之间的一种生物学语言[129]。拉赫曼教授将其描述为一种新兴技术，可用于疾病指纹识别或预测药物效果[130]。2015年，王喜军教授在爱思唯尔出版了一本关于中国组学的专著[131]，并在科学出版社（2016-2021）的《中国组学研究进展》年刊中出版了六部系列专著[132–137]。

图 4：Chinme组学筛选中药有效成分的工作流程。PCMS：标记代谢物与血清成分之间的相关性图

Chinme组学已被用于评估约20种经典中药复方的疗效并阐明其机制，表4[138–154]提供了这些复方的总结。我们将以YHS和YCHD为例来介绍 Chinmedomics 的细节。YHS是黄疸综合征的湿热表型，临床症状为发热；烦渴；眼白、粘膜和皮肤呈亮黄色变色；浓茶色深色尿液；伴有食欲不振或恶心呕吐[155]。YCHD是常用于治疗YHS的经典处方；数千年来对人类受试者的实验表明，临床效果显著[156]。然而，目前尚不清楚哪些特定的活性成分作用于哪些靶点以产生治疗效果，而Chinmeomics为解决这个问题提供了一种新的研究范式。研究人员首次引入了代谢组学技术，用于中医综合征的小分子代谢物水平表征。将伴随 YHS 的患者与健康受试者进行比较，成功鉴定了40个尿代谢差异标志物；这些主要包括驱动素、胆色素原和吲哚丙烯酸[157]。该方法实现了对中医证候的准确定量表征，为准确评价中医疗效奠定了基础。在最近一项关于黄疸患者血液代谢组学的研究中，成功鉴定了14种不同的代谢物，包括牛磺胆酸、胆红素葡糖苷酸、胆红素和胆绿素，这表明它们可以作为临床诊断黄疸的有效补充剂。此外，YCHD治疗后，患者临床症状明显改善，13项血液代谢生物标志物含量发生明显改变，恢复正常水平。利用YCHD血清药理化学在临床受试者体内成功鉴定出26种原型成分和3种代谢物，疗效显著，与生物标志物的相关性分析显示，京尼泊苷、东莨菪酮、异鼠李素、槲皮素、柚皮素、大黄素、绿原酸和山奈酚与临床疗效相关[158]。

表 4：中药有效成分的代表性研究

在使用YHS动物模型的相关研究中，成功鉴定了33种小鼠尿液代谢生物标志物。其中，肾上腺素、5-甲氧基色氨酸、犬尿烯酸、5,6-二氢尿苷、葡萄糖酸、苯丙酮酸等10项生物标志物与临床研究结果一致[159]。通过这种方式，动物模型成功地复制了临床中医证候。在血液代谢组学研究中，表征了12种生物标志物；在这些代谢物中，在人类患者和小鼠血清样本中都发现了三种常见的标志物，即胆红素、胆绿素和牛磺胆酸。YCHD胃内给药后，10种血清生物标志物含量明显降低，小鼠肝脏组织病理学及代谢特征与对照组相似。此外，在小鼠血清中共表征了33种原型成分和3种代谢物；其中，21种化学成分与临床样本结果相似。综上所述，通过多维整合分析、网络数据库挖掘和蛋白表达水平实验验证，鉴定了YCHD的有效成分，包括京尼泊苷、东莨菪酮、异鼠李素、槲皮素、柚皮素、大黄素、绿原酸和山奈酚。它们调节CYP7A、ABCC2、ABCC3、UGT1A1、FXR蛋白靶标，协同调节初级胆汁酸生物合成、卟啉和叶绿素代谢以及胆汁分泌，发挥其作为胆汁和抗黄疸药物的治疗作用[158]。此外，许多其他研究结果也支持上述研究结果[146,160–163]。

综上所述，Chinmeomics结合了最先进的整合思想和技术手段，为深入分析中医药处方的疗效和机制创造了新的思路和策略[128]。Chinmemomics专注于中医综合症和复方，并考虑临床疗效，避免了化学成分简单分离的盲目性，这是早期阶段的标志。特别是，该方法解决了体内中药成分与疾病靶点和途径不匹配的科学问题。探讨了该公式对综合征生物标志物和相关代谢途径的潜在机制，找到了有效成分的靶点和途径，并进一步阐明了中药具有多成分和多靶点的特征。中药的某些成分不需要被吸收到血液中才能起到治疗作用；其中一些可以通过直接调节肠道菌群来改善疾病[164–166]。因此，Chinmeomics还整合了肠道微生物群代谢，以识别体内多个部位的成分，例如粪便和肠道内容物。此外，系统生物学方法，如基因组学[167]、转录组学[168]、蛋白质组学[169]等技术，可综合运用，丰富Chinmeomics，多指标、多视角补充实验结果。此外，应将大数据分析和人工智能引入Chinmedomics，以提高其科学性和可靠性。对 Chinmedomics 的扩展研究如图5所示。

图 5：Chinmedomics-expanded（一种血清药物化学和系统生物学的综合验证分析方法）的工作流程

结论